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生物大分子的液_固色譜純化過程中固相載體會產(chǎn)生產(chǎn)物吸附、變性等不良影響。高速逆流色譜無需固相載體 ,且具有高分便率和高回收率的優(yōu)點 ,其中有機相 水相體系在分離天然產(chǎn)物中應用廣泛 ,而應用雙水相體系分離生物大分子尚處于研究階段。雙水相高速逆流色譜體系的建立與儀器設備及操作工藝條件密切相關 ,因此利用多分離柱高速逆流色譜儀 ,研究了PEG10 0 0_無機鹽雙水相體系對標準蛋白質(zhì)混合物以及卵白蛋白的分離。pH值和PEG濃度對不同種類蛋白質(zhì)的分配系數(shù)影響不同 ,實驗發(fā)現(xiàn)在pH9 2的 15 0 % (W W)PEG10 0 0 17 0 % (W W)磷酸鉀鹽體系中 ,細胞色素C、溶菌酶和肌紅蛋白的分配系數(shù)差異較大 ,且分布合理 ,因而采用該體系在 0 8mL min流速 ,85 0r min轉(zhuǎn)速的條件下 ,成功分離了細胞色素C、溶菌酶和肌紅蛋白的混合物。實驗也發(fā)現(xiàn)在pH9 2的 16 0 % (W W)PEG10 0 0 17 0 % (W W)磷酸鉀鹽體系中 ,雞蛋清樣品中的主要蛋白質(zhì)成分 :卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白和溶菌酶的分配系數(shù)差異最大 ,因而采用該體系在 1 8mL min流速、85 0r min轉(zhuǎn)速的條件下 ,2 0 0min內(nèi)從雞蛋清樣品中成功分離卵白蛋白 ,其電泳純度為 10 0 % ,收率為 95 %。
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目的探討多聚蛋白多糖(Aggrecan)過表達載體修飾骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)來源外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對新西蘭大白兔軟骨缺損的修復作用。方法培養(yǎng)兔源性BMSCs,流式細胞儀檢測第2代BMSCs表面蛋白CD44、CD29、CD34和CD45表達。慢病毒Aggrecan過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs,超速離心法提取外泌體,Western Blot方法檢測外泌體分子標志物CD81和CD63的表達。構建絲素蛋白支架聯(lián)合外泌體復合物,利用掃描電鏡技術檢測絲蛋白支架的結構。利用蘇木精-伊紅(HE)染色和番紅-快綠染色檢測新西蘭大白兔軟骨缺損模型中軟骨結構。結果第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表達分別為60.2%和58.3%,CD34和CD45表達分別為3.4%和2.6%。慢病毒Aggrecan過表達載體轉(zhuǎn)染效率為(95±2)%。掃描電鏡觀察顯示,外泌體為直徑40～100nm雙層膜的膜狀結構。Western Blot檢測顯示,外泌體可以表達分子標志物CD81和CD63。HE染色和番紅-快綠染色結果顯示,Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復作用明顯優(yōu)于BMSC組和陰性對照組(F=19.298、12.548,P<0.05)。結論 Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復具有明顯的促進作用,可為骨性關節(jié)炎治療提供新的思路與方法。
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